技术简介

染色质免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation)，简称CHIP；是目前研究体内DNA与蛋白质相互作用的唯一方法，它不仅可以检测体内反式作用因子与DNA的相互作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达关系。

实验流程

• 样本处理-超声检测-input检测及反馈-免疫沉淀-洗脱-产物检测-结果分析

实验步骤

1. Input检测及免疫沉淀
   • Day1：
     1. （一）细胞的甲醛交联与超声破碎
        1. 1、取出1平皿细胞，按照终浓度为1%的比例加入37％甲醛；
        2. 2、37℃孵育10min；
        3. 3、终止交联：按照终浓度为125mM的比例加2.5M甘氨酸于平皿中。混匀后，在室温下放置5min即可；
        4. 4、吸尽培养基，用冰冷的PBS清洗细胞3次；
        5. 5、用PBS将细胞刮下来，2000g离心5min，去上清
        6. 6、加入含蛋白酶抑制剂的IP裂解液裂解细胞；
        7. 7、冰上充分裂解30min，过程中用枪反复吹打细胞，使其充分裂解；
        8. 8、超声破碎：超声过程中请一定注意要保持样品处于冰浴中，避免超声出现泡沫，并且处于较低温度；
     2. （二）除杂及抗体哺育
        1. 1、超声破碎结束后，离心去除不溶物质，取上清；留取90μl做input，其余保存于－80度。
        2. 2、取40μl留作Input的超声破碎产物，加入 5*还原型蛋白上样缓冲液10μl，加热变性后进行WB检测，确认样品中含有目标蛋白。剩下50μl产物加入5μl的蛋白酶K和2μl 5M NaCl（NaCl终浓度为0.2M），55℃过夜解交联；
        3. 3、解交联结束后，测核酸浓度，取部分样品进行PCR扩增，然后跑琼脂糖电泳，检测超声破碎的效果和确认样品中含有目标DNA；
        4. 4、Input结果确认后，取冻存在-80℃冰箱中的超声破碎产物100μl，加入 含1mM-PMSF的ChIP Dilution Buffer和20μl的50×PIC。再各加入Protein A +G Agarose/Salmon Sperm DNA。4℃颠转混匀1h；
        5. 5、1h后，在4℃静置10min沉淀，4000rpm离心5min；
        6. 6、将样品分装至两支1.5mL EP管，一管中加入目的蛋白IP 抗体1μg，另一管中加入对应种属的IgG 1μg。4℃颠转过夜；
   • Day2：
     1. （一）免疫复合物的沉淀及清洗
        1. 1、孵育过夜后，每管中加入200μl Protein A+G Agarose/Salmon Sperm DNA，4℃颠转2h；
        2. 2、4℃静置10min后，4000rpm离心1min。除去上清；
        3. 3、依次用下列溶液清洗沉淀复合物。清洗的步骤：加入溶液，轻轻颠倒， 4000rpm离心3min，去除上清；注：完成上述所有洗涤步骤后所获得的沉淀即可用于Western检测，在完成所有的洗涤步骤后，取30μl样品加入30μl SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(1X)，沸水浴煮沸10分钟后上样进行WB；
        4. 4、现配elution buffer（0.5gSDS+0.42gNaHCO3+50ml水），加200μl至EP管；
        5. 5、加5M NaCl 8μL，Protease K 20μL，55℃过夜解交联；
   • Day3：
     1. 蛋白酶K解交联（55℃过夜→DNA纯化）
     2. PCR验证（JASPAR预测结合位点→设计引物→2%琼脂糖电泳）
     3. 或送NGS测序分析

送样要求及结果交付