服务项目
Western Blot
服务概述
蛋白质印迹(Western blotting)又称免疫印迹(immunoblotting)，它是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的母的蛋白的方法。
服务周期：
技术介绍
蛋白质印迹(Western blotting)又称免疫印迹(immunoblotting)，它是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的母的蛋白的方法。
该方法包括三个部分：
- 1.DS-PAGE凝胶电泳
- 2.蛋白质的电泳转移
- 3.免疫印迹分析
由于免疫印迹具有SDS-PAGE的高分辨力和免疫测定的高特异性和敏感性，现已成为蛋白质分析领域的一种常规技术。免疫印迹常用于鉴定目的蛋白，并能对蛋白进行定性和半定量分析。
实验流程
实验步骤
- 1.获取细胞或组织裂解物
- 2.蛋白质定量：常用的蛋白定量方法：Bradford assay, Lowry assay 或BCA assay。定量后，可根据情况将标本保存在-20°C /-80°C备用，或者直接进行电泳分离蛋白；
- 3.电泳分离蛋白质
- 4.转膜:根据不同的检测目的和待测蛋白的特性,选择合适的膜类型。常用的转移膜类型有PVDF膜、硝酸纤维素膜（NC膜）和尼龙膜，其中PVDF和NC膜的使用频率最高；
- 5.封闭：去掉膜上多余的非特异性结合位点，降低背景。常用的封闭溶液有含BSA或者脱脂奶粉的TBST或TBS；
- 6. 孵育一抗：一抗的选择成功与否，是整个WB实验成功的关键；
- 7. 孵育二抗：根据说明书推荐浓度使用TBST稀释。如果说明书没有推荐浓度，可进行多个稀释比例进行摸索最佳稀释度（1:1000-1:20000）。孵育条件一般为室温1-2小时；
- 8. 底物孵育：选择显色或者化学发光底物。一般倾向于化学发光，灵敏度高且背景低，节省抗体用量；
- 9. 结果分析和检测：凝胶成像系统检测或者暗室曝光到胶片。
案例：实验结果展示
1. BCA蛋白定量示例图
2. WB结果示例合成图
客户提供
- 足够量的生物样品（需提前说明具体要求）
- 适合的一抗（如需代购需提前说明）
- 相关背景资料
注意事项
- 一抗/二抗的稀释度、作用时间和温度需通过预实验优化
- 显色液需新鲜配制，最后加入H₂O₂
- DAB具有潜在致癌性，操作时需严格防护