服务项目
原位杂交（FISH三标）
服务概述
原位杂交原理：原位杂交是指将特定标记的已知顺序核酸为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交，从而对特定核酸顺序进行精确定量定位的过程。原位杂交可以在细胞标本或组织标本上进行。实验采用三种标记不同荧光素的不同探针，同时检测一个样本。适用于各类细菌检测和其他基因检测。
服务周期：
原位杂交（FISH三标）技术介绍
技术原理：通过三种不同荧光素标记的核酸探针（如FITC/Cy3/Cy5）同步检测多个靶序列，结合DAPI核染色实现多目标共定位分析。适用于环境微生物检测（如硝化细菌/甲烷菌群落分析）及染色体多位点检测。
实验流程
- 样本固定：污泥切片4%多聚甲醛（DEPC配制）固定20min→PBS洗涤3次（摇床100rpm）
- 透化处理：蛋白酶K（20μg/ml）37℃消化20min→超纯水终止→0.01M HCl处理5min增强探针渗透
- 探针杂交：预杂交液（含50%甲酰胺）37℃封闭1h→三探针混合液（各50nM）37℃杂交16h
- 严谨洗涤：2×SSC（含0.1% SDS）37℃洗10min→梯度SSC洗涤（逐步降低盐浓度至0.5×）
- 信号增强：含DAPI的抗淬灭剂封片→避光静置10min使荧光稳定
- 全景扫描：全自动荧光扫描仪20×物镜成像，Z-stack层厚0.5μm消除焦平面误差
案例展示
结果判读
荧光信号判读：
• 探针1（FITC）：激发488nm/发射520nm，显示绿色荧光
• 探针2（Cy3）：激发550nm/发射570nm，显示红色荧光
• 探针3（Cy5）：激发650nm/发射670nm，显示远红色荧光
• 共定位区域显示混合色（如黄色/品红色），需通过荧光光谱拆分验证
送样运输要求
- 污泥样本：4%多聚甲醛固定后常温运输，避免剧烈震荡
- 生物膜样本：转移至无菌离心管，加入固定液浸没，4℃运输
- 极端环境样本：需注明保存温度（如厌氧样本需充氮气保护）
- 国际运输：符合IATA生物安全标准，提供MSDS证明
注意事项
- 三探针Tm值差异需≤5℃，确保同步杂交效率
- 甲酰胺浓度需≥40%降低非特异性结合
- 环境样本需进行超声预处理（40kHz 5min）分散菌胶团
- 成像后需立即-80℃避光保存切片，防止荧光淬灭