服务项目
原位杂交（FISH、IF双染）
服务概述
原位杂交原理：原位杂交是指将特定标记的已知顺序核酸为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交，从而对特定核酸顺序进行精确定量定位的过程。原位杂交可以在细胞标本或组织标本上进行。IF即免疫荧光，可检测组织或细胞中某蛋白的表达情况及定位。 原位杂交(FISH、IF双标)可以检测靶基因与靶蛋白的共定位情况。
服务周期：
技术介绍
技术原理：通过荧光标记核酸探针（FISH）与靶基因特异性结合，同时利用荧光二抗标记目标蛋白（IF），实现核酸-蛋白共定位分析。DAPI染色显示细胞核，适用于研究miRNA-mRNA-蛋白调控网络。
实验流程（石蜡切片）
- 组织处理：4%多聚甲醛DEPC水固定6h→梯度乙醇脱水→石蜡包埋→4μm切片62℃烘烤2h
- 脱蜡修复：二甲苯脱蜡→梯度乙醇水化→柠檬酸钠（pH6.0）95℃热修复15min
- 探针杂交：蛋白酶K（20μg/ml）37℃消化20min→预杂交液封闭→Cy3标记探针（80nM）37℃过夜杂交
- 免疫荧光：一抗（如α-SMA 1:200）4℃过夜→FITC标记二抗（1:500）室温50min
- 成像处理：DAPI染核8min→抗淬灭剂封片→共聚焦显微镜多通道采集（Cy3/FITC/DAPI）
实验流程（冰冻切片）
- 样本制备：OCT包埋→-80℃速冻→恒温切片机-20℃切6μm厚片
- 预处理：4%多聚甲醛固定10min→0.3% Triton X-100透化→蛋白酶K（5μg/ml）37℃消化3min
- 探针杂交：FAM标记探针（100nM）42℃杂交16h→0.1×SSC 42℃严谨洗涤
- 免疫染色：抗GFAP抗体（1:500）4℃过夜→Cy5标记二抗（1:1000）室温孵育
- 成像优化：DAPI染核→抗荧光衰减封片剂→Z-stack扫描消除光学伪影
案例展示
结果判读
荧光信号：DAPI核染（蓝），miRNA（红/绿）定位于胞质，蛋白标记（绿/红）根据靶标分布于胞膜/胞质。共定位区域显示黄色叠加信号，需用ImageJ插件计算Pearson相关系数（＞0.5为显著共定位）。
送样运输要求
- 冰冻样本：OCT包埋块-80℃保存，干冰运输；切片需浸存固定液4℃运输
- 石蜡样本：常温运输石蜡块，切片密封避光保存
- 活细胞样本：专用运输培养基4℃维持≤72小时
- 特殊要求：荧光样本需铝箔纸全程避光
注意事项
- 探针与抗体需光谱兼容（Cy3/FITC/Cy5间隔≥50nm）
- 全程RNase-free环境：DEPC水处理试剂，烘烤耗材
- 设置对照：阳性对照（已知共定位样本）+阴性对照（不加探针/一抗）
- 图像采集需统一曝光参数，避免荧光强度人为偏差