服务项目
原位杂交（FISH、FISH、IF三染）
服务概述
原位杂交与免疫荧光原理：原位杂交是指将特定标记的已知顺序核酸为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交，从而对特定核酸顺序进行精确定量定位的过程。原位杂交可以在细胞标本或组织标本上进行。免疫荧光就是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体或抗原上，与其相应的抗原或抗体结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。 通过原位杂交双探针及免疫荧光进行三标，可以在组织细胞中对核酸分子和蛋白指标同时进行共定位、以及定性分析，可以用来从共定位角度提示核酸和蛋白存在相互作用。
服务周期：
原位杂交（FISH/IF三染）技术介绍
技术原理：结合荧光原位杂交（FISH）双探针与免疫荧光（IF）技术，通过不同荧光标记的核酸探针（如Cy3/FITC）与靶RNA/DNA杂交，同时利用荧光二抗标记目标蛋白，实现核酸-蛋白共定位分析（DAPI染核）。适用于研究miRNA-mRNA-蛋白调控网络等分子互作。
实验流程
- 样本前处理：
组织经4%多聚甲醛固定→梯度乙醇脱水→石蜡包埋→切片厚度4μm→二甲苯脱蜡至水化 - 抗原修复与消化：
柠檬酸盐缓冲液（pH6.0）95℃热修复15min→蛋白酶K（10μg/ml）37℃消化10min - 预杂交：
滴加含tRNA的预杂交液，37℃封闭非特异性结合1小时 - 双探针杂交：
更换含FITC标记probe1（100nM）和Cy3标记probe2（80nM）的杂交液，42℃过夜杂交16小时 - 严谨洗涤：
2×SSC（42℃ 10min）→1×SSC（37℃ 2×5min）→0.5×SSC（室温10min） - 免疫荧光染色：
一抗（如抗目标蛋白小鼠单抗，1:200）4℃孵育过夜→Cy5标记山羊抗小鼠二抗（1:500）室温50min - 核染色：
DAPI（1μg/ml）避光染核8min，PBS冲洗后抗淬灭剂封片 - 图像采集：
激光共聚焦显微镜多通道采集（DAPI/FITC/Cy3/Cy5），Z-stack扫描消除光学切片干扰
案例展示
结果判读
荧光信号：DAPI（蓝色）标记细胞核，FITC（绿色）和Cy3（红色）显示双靶核酸定位，Cy5（远红色）标记目标蛋白。共定位区域显示叠加色（如黄色/白色），需通过Manders系数定量共定位程度。
送样运输要求
- 冰冻样本：OCT包埋后-80℃保存，干冰运输
- 石蜡样本：固定后组织块常温运输，切片避光常温保存
- 活细胞样本：专用细胞保存液4℃运输，72小时内处理
- 注意事项：严禁反复冻融，荧光样本需铝箔纸避光包装
注意事项
- 探针与抗体需光谱分离（如FITC/Cy3/Cy5间隔≥50nm）
- 全程避光操作，二抗孵育后需彻底洗脱未结合抗体
- 设置单染对照组排除荧光通道串扰
- 共聚焦显微镜需定期校准通道配准参数