服务项目
原位杂交（DAB）
服务概述
原位杂交原理：原位杂交是指将特定标记的已知顺序核酸为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交，从而对特定核酸顺序进行精确定量定位的过程。原位杂交可以在细胞标本或组织标本上进行。
服务周期：
技术介绍
原位杂交原理：通过标记核酸探针与组织/细胞内的靶核酸序列特异性结合，利用辣根过氧化物酶（HRP）催化DAB显色反应，实现核酸定位。阳性信号呈棕黄色，适用于福尔马林固定石蜡包埋样本。
实验流程
- 组织固定：新鲜组织立即浸入DEPC水配制的4%多聚甲醛，固定2-12小时。
- 脱水包埋：梯度乙醇（70%→80%→95%→100%）脱水，二甲苯透明，石蜡浸透包埋。
- 切片处理：石蜡切片厚度4μm，62℃烘烤2小时增强附着力。
- 脱蜡水化：二甲苯Ⅰ/Ⅱ各15min→无水乙醇梯度→DEPC水洗涤。
- 抗原修复：柠檬酸缓冲液（pH6.0）95℃热修复15min，自然冷却至室温。
- 蛋白酶消化：蛋白酶K（20μg/ml）37℃消化20min，PBS终止反应。
- 阻断内源酶：3% H2O2-甲醇室温阻断15min，消除内源性过氧化物酶活性。
- 预杂交：滴加预杂交液覆盖组织，37℃封闭非特异性结合1小时。
- 杂交反应：含DIG标记探针的杂交液37℃过夜孵育（16-18小时）。
- 严谨洗涤：2×SSC→1×SSC→0.5×SSC梯度洗涤，去除未结合探针。
- 抗体孵育：抗地高辛-HRP复合物37℃反应40min，PBS充分洗涤。
- DAB显色：新鲜配制DAB工作液（0.05% DAB + 0.03% H2O2），显微镜下控制显色2-10min。
- 核复染：Harris苏木素染色3min→1%盐酸酒精分化→氨水返蓝。
- 脱水封片：乙醇梯度脱水→二甲苯透明→中性树胶封片。
- 结果分析：光学显微镜下观察，棕黄色为阳性信号，细胞核呈蓝色。
案例展示
结果判读
阳性信号为棕黄色颗粒状沉积，定位于细胞质或细胞核（根据靶RNA类型）；苏木素复染细胞核呈蓝色。需排除非特异性着色（如边缘效应或红细胞内源性过氧化物酶干扰）。
送样运输要求
- 冰冻样本：固定液浸泡后常温运输，冰冻切片需-20℃干冰运输
- 石蜡样本：固定后组织块常温运输，切片常温避光保存
- 细胞爬片：4%多聚甲醛固定15min，密封湿盒4℃运输
- 新鲜组织：速冻后-80℃保存，干冰运输至检测中心
注意事项
- 全程使用DEPC处理水配制试剂，耗材需180℃烘烤4小时去除RNase
- DAB显色液需现用现配，操作时佩戴防毒面具
- 苏木素复染后需充分返蓝，避免核染色过深掩盖阳性信号
- 设立阳性对照（已知表达组织）和阴性对照（不加探针）