服务项目
原位杂交（BCIP/NBT）
服务概述
原位杂交原理：原位杂交是指将特定标记的已知顺序核酸为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交，从而对特定核酸顺序进行精确定量定位的过程。原位杂交可以在细胞标本或组织标本上进行。
服务周期：
原位杂交（BCIP/NBT）技术介绍
原位杂交原理：原位杂交是指将特定标记的已知顺序核酸作为探针与细胞或组织切片中的核酸进行杂交，从而对特定核酸顺序进行精确定量定位的过程。该技术可在细胞或组织标本上实现靶标核酸的形态学定位与定量分析。
实验流程
- 组织固定：组织取出后立即用DEPC水配制的固定液固定2-12小时。
- 脱水与包埋：经梯度酒精（75%→85%→无水乙醇）脱水后浸蜡，石蜡包埋。
- 切片处理：石蜡切片机切片，摊片机捞片，62℃烤箱烤片2小时。
- 脱蜡至水：依次经二甲苯Ⅰ（15min）→二甲苯Ⅱ（15min）→无水乙醇Ⅰ（5min）→无水乙醇Ⅱ（5min）→85%酒精（5min）→75%酒精（5min）→DEPC水洗。
- 组织消化：修复液煮沸切片10-15分钟，自然冷却后滴加蛋白酶K（20ug/ml）37℃消化20-30分钟，PBS冲洗3次×5分钟。
- 预杂交：滴加预杂交液，37℃孵育1小时。
- 杂交反应：更换含探针的杂交液，37℃恒温箱过夜杂交。
- 洗涤：2×SSC（37℃ 10min）→1×SSC（37℃ 2×5min）→0.5×SSC（室温10min），高背景时可增加甲酰胺洗涤。
- 封闭：滴加BSA封闭血清，室温封闭30分钟。
- 抗体孵育：滴加鼠抗地高辛标记碱性磷酸酶（anti-DIG-AP），37℃孵育40分钟，TBS冲洗4次×5分钟。
- 显色：滴加BCIP/NBT显色液，显微镜下观察蓝色/蓝紫色阳性信号，纯水终止。
- 复染核：核固红染液染色至细胞核清晰，纯水冲洗。
- 封片：自然风干后中性树胶封片。
- 结果分析：显微镜下采集图像并进行定量分析。
案例展示
结果判读
阳性信号呈蓝色或蓝紫色沉淀，细胞核经核固红复染为红色。需注意排除非特异性染色（如边缘效应或试剂残留）。
送样运输要求
- 冰冻样本：标本需置于原位杂交固定液，常温运输；冰冻切片需-20℃运输。
- 石蜡样本：组织固定后常温运输，石蜡切片常温运输。
- 细胞爬片：固定15分钟后密封，4℃运输；共聚焦皿需特殊包装。
- 新鲜组织：立即冷冻后-80℃保存，干冰运输至检测机构。
注意事项
- 全程使用DEPC水处理试剂及耗材，避免RNA酶污染。
- 蛋白酶K消化时间需根据组织类型调整，过度消化会导致切片脱落。
- 显色阶段需严格控制时间，避免背景过深。
- 杂交液探针浓度需预实验优化，建议设置阳性和阴性对照。