技术介绍

组织芯片的免疫荧光检测，是将许多不同个体组织标本以规则微阵列方式排布于同一载玻片上，同时进行相同指标的免疫荧光检测。组织芯片荧光四标实验是在同一张组织芯片上对四个抗原进行同时标记，从而实现定性、定位、半定量分析。组织芯片的免疫荧光检测具有标本体积小、标本信息含量大、一次性实验即可获大量结果的特点。实验条件更易控制一致，减少批间批内误差，结果更准确。

实验流程

1. 石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-85%酒精5min-75%酒精5min-蒸馏水洗。

2. 抗原修复：组织切片置于盛满EDTA抗原修复缓冲液（PH8.0）的修复盒中于微波炉内进行抗原修复。中火8min停火8min转中低火7min，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。（修复液和修复条件根据组织来确定）

3. 画圈：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止抗体流走）。

4. 血清封闭：在圈内滴加BSA孵育30min。（一抗若是山羊来源，则加兔血清）

5. 加第一种一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）

6. 加对应的HRP标记的二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的HRP标记的二抗覆盖组织，室温孵育50min。

7. 加CY3荧光增强剂：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加CY3荧光增强剂，避光室温孵育10min。孵育完后，玻片置于TBST中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

8. 微波处理：组织切片置于盛满EDTA抗原修复缓冲液（PH8.0）的修复盒中于微波炉内加热处理，中火8min停火8min转中低火7min，去掉已经结合到组织上的一抗二抗，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。

9. 加第二种一抗：在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）

10. 加对应的HRP标记的二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的HRP标记的二抗覆盖组织，避光室温孵育50min。

11. 加FITC荧光增强剂：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加FITC荧光增强剂，避光室温孵育10min。孵育完后，玻片置于TBST中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

12. 微波处理：组织切片置于盛满EDTA抗原修复缓冲液（PH8.0）的修复盒中于微波炉内加热处理，中火8min停火8min转中低火7min，去掉已经结合到组织上的一抗二抗，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。

13. 加第三种一抗：在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）

14. 加对应的HRP标记的二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的HRP标记的二抗覆盖组织，避光室温孵育50min。

15. 加647荧光增强剂：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加647荧光增强剂，避光室温孵育10min。孵育完后，玻片置于TBST中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

16. 微波处理：组织切片置于盛满EDTA抗原修复缓冲液（PH8.0）的修复盒中于微波炉内加热处理，中火8min停火8min转中低火7min，去掉已经结合到组织上的一抗二抗，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。

17. 加第四种一抗：在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）

18. 加594标记的荧光二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的594标记荧光二抗覆盖组织，避光室温孵育50min。孵育完后，玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

19. DAPI复染细胞核：切片稍甩干后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。

20. 自发荧光淬灭：切片稍甩干后，在圈内加入自发荧光淬灭剂5min，流水冲洗10min。

21. 封片：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。

22. 镜检拍照：切片置于扫描仪下采集图像。（DAPI紫外激发波长330-380nm，发射波长420nm，发蓝光；FITC激发波长465-495nm，发射波长515-555nm，发绿光；CY3激发波长510-560nm，发射波长590nm，发红光；CY5激发波长608-648nm，发射波长672-712nm。CY5原本为正红色，为了与CY3区分开，设定为粉色光。594激发波长594nm，发射波长615nm，设定为紫红色。最后成像时DAPI染出的细胞核为蓝色，阳性表达为相应荧光素标记的红光、粉光、绿光、紫红光。）

实验步骤

案例：实验结果展示

结果判读

送样运输要求

1. 样本放置于20倍样本体积的固定液中固定24h以上，常温运输送样。

2. 切勿固定时间过长，切勿冷冻结冰。

3. 荧光四标只能做石蜡包埋切片，不能做冰冻切片和细胞爬片。

注意事项

① 微波修复需全程监控液体蒸发量；② 四种一抗需匹配不同种属来源的二抗；③ CY3/FITC/647/594荧光通道需独立采集图像防止串色；④ 封片后需在24小时内完成成像；⑤ 石蜡切片运输需密封防潮避光；⑥ 594与CY3荧光信号需通过波长设定严格区分。