技术介绍

免疫荧光双重标记即利用抗原抗体特异性结合原理，在同一张切片上对两个抗原进行同时标记，从而实现定位、定性、半定量的分析。

实验流程

异源双标：

1. 石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-85%酒精5min-75%酒精5min-蒸馏水洗。

2. 抗原修复：组织切片置于盛满EDTA抗原修复缓冲液（PH8.0）的修复盒中于微波炉内进行抗原修复。中火8min停火8min转中低火7min，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。（修复液和修复条件根据组织来确定）

3. 画圈：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止抗体流走）。

4. 血清封闭：在圈内滴加BSA孵育30min。（一抗若是山羊来源，则加兔血清）

5. 加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，两种一抗按一定的稀释比例混合，滴加到组织上，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）

6. 加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属标记的按一定比例配好的二抗覆盖组织，室温孵育50min。（两种二抗按照一定的比例混合孵育）

7. DAPI复染细胞核：切片稍甩干后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。

8. 自发荧光淬灭：切片稍甩干后，在圈内加入自发荧光淬灭剂5min，流水冲洗10min。

9. 封片：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。

10. 镜检拍照：切片置于扫描仪下采集图像。（DAPI紫外激发波长330-380nm，发射波长420nm，发蓝光；FITC激发波长465-495nm，发射波长515-555nm，发绿光；CY3激发波长510-560nm，发射波长590nm，发红光；CY5激发波长608-648nm，发射波长672-712nm。DAPI染出来的细胞核在紫外的激发下为蓝色，阳性表达为相应荧光素标记的红光、绿光。）

同源双标：

1. 石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-85%酒精5min-75%酒精5min-蒸馏水洗。

2. 抗原修复：组织切片置于盛满EDTA抗原修复缓冲液（PH8.0）的修复盒中于微波炉内进行抗原修复。中火8min停火8min转中低火7min，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。（修复液和修复条件根据组织来确定）

3. 画圈：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止抗体流走）。

4. 血清封闭：在圈内滴加BSA孵育30min。（一抗若是山羊来源，则加兔血清）

5. 加第一种一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）

6. 加对应的HRP标记的二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的HRP标记的二抗覆盖组织，室温孵育50min。

7. 加CY3荧光增强剂：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加CY3荧光增强剂，避光室温孵育10min。孵育完后，玻片置于TBST中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

8. 微波处理：组织切片置于盛满EDTA抗原修复缓冲液（PH8.0）的修复盒中于微波炉内加热处理，中火8min停火8min转中低火7min，去掉已经结合到组织上的一抗二抗，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。

9. 加第二种一抗：在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）

10. 加对应的HRP标记的二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的HRP标记的二抗覆盖组织，避光室温孵育50min。

11. 加FITC荧光增强剂：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加FITC荧光增强剂，避光室温孵育10min。孵育完后，玻片置于TBST中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

12. DAPI复染细胞核：切片稍甩干后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。

13. 自发荧光淬灭：切片稍甩干后，在圈内加入自发荧光淬灭剂5min，流水冲洗10min。

14. 封片：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。

15. 镜检拍照：切片置于扫描仪下采集图像或荧光显微镜下拍照。（DAPI紫外激发波长330-380nm，发射波长420nm，发蓝光；FITC激发波长465-495nm，发射波长515-555nm，发绿光；CY3激发波长510-560nm，发射波长590nm，发红光；CY5激发波长608-648nm，发射波长672-712nm。DAPI染出来的细胞核在紫外的激发下为蓝色，阳性表达为相应荧光素标记的红光、绿光。）

实验步骤

案例：实验结果展示

结果判读

送样运输要求

1. 冰冻切片-20℃保存和运输。

2. 石蜡切片常温运输至实验室。

3. 细胞爬片用固定液浸泡，4℃保存和运输。

备注：同源双标只能做石蜡切片，不能做冰冻切片和细胞爬片。

注意事项

① 异源双标需确保两种一抗/二抗种属来源不同；② 同源双标需通过微波处理彻底去除前次抗体；③ 荧光增强剂孵育时间需精确控制；④ FITC/CY3通道需分开采集图像；⑤ 石蜡切片运输时需防潮避光。