技术介绍

免疫荧光三重标记即利用抗原抗体特异性结合原理，在同一张切片上对3个抗原进行同时标记，从而实现定位、定性、半定量的分析。

实验流程

1. 石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-85%酒精5min-75%酒精5min-蒸馏水洗。

2. 抗原修复：组织切片置于盛满EDTA抗原修复缓冲液（PH8.0）的修复盒中于微波炉内进行抗原修复。中火8min停火8min转中低火7min，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。（修复液和修复条件根据组织来确定）

3. 画圈：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止抗体流走）。

4. 血清封闭：在圈内滴加BSA孵育30min。（一抗若是山羊来源，则加兔血清）

5. 加第一种一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）

6. 加对应的HRP标记的二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的HRP标记的二抗覆盖组织，室温孵育50min。

7. 加CY3荧光增强剂：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加CY3荧光增强剂，避光室温孵育10min。孵育完后，玻片置于TBST中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

8. 微波处理：组织切片置于盛满EDTA抗原修复缓冲液（PH8.0）的修复盒中于微波炉内加热处理，中火8min停火8min转中低火7min，去掉已经结合到组织上的一抗二抗，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。

9. 加第二种一抗：在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）

10. 加对应的HRP标记的二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的HRP标记的二抗覆盖组织，避光室温孵育50min。

11. 加FITC荧光增强剂：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加FITC荧光增强剂，避光室温孵育10min。孵育完后，玻片置于TBST中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

12. 微波处理：组织切片置于盛满EDTA抗原修复缓冲液（PH8.0）的修复盒中于微波炉内加热处理，中火8min停火8min转中低火7min，去掉已经结合到组织上的一抗二抗，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。

13. 加第三种一抗：在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）

14. 加CY5标记的荧光二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的CY5标记荧光二抗覆盖组织，避光室温孵育50min。孵育完后，玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

15. DAPI复染细胞核：切片稍甩干后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。

16. 自发荧光淬灭：切片稍甩干后，在圈内加入自发荧光淬灭剂5min，流水冲洗10min。

17. 封片：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。

18. 镜检拍照：切片置于扫描仪下采集图像。（DAPI紫外激发波长330-380nm，发射波长420nm，发蓝光；FITC激发波长465-495nm，发射波长515-555nm，发绿光；CY3激发波长510-560nm，发射波长590nm，发红光；CY5激发波长608-648nm，发射波长672-712nm。CY5原本为正红色，为了与CY3区分开，我们设定为粉色光。DAPI染出来的细胞核在紫外的激发下为蓝色，阳性表达为相应荧光素标记的红光、粉光、绿光。）

实验步骤

案例：实验结果展示

结果判读

DAPI染出来的细胞核在紫外的激发下为蓝色，阳性表达为相应荧光素标记的红光、粉光、绿光。

送样运输要求

1. 样本放置于20倍样本体积的固定液中固定24h以上，常温运输送样。

2. 切勿固定时间过长，切勿冷冻结冰。

3. 荧光三标只能做石蜡包埋切片，不能做冰冻切片和细胞爬片。

注意事项

① 微波处理时需全程监控液体量，避免干片；② 不同一抗需严格匹配对应物种来源的二抗；③ CY3/FITC/CY5三种荧光通道需分开采集图像，避免串色；④ 封片后需在24小时内完成拍照以防止荧光衰减；⑤ 石蜡切片运输时需密封防潮。