Edu染色

技术介绍

EdU(5-Ethynyl-2’- deoxyuridine)是一种胸腺嘧啶核苷类似物，能够在细胞增殖时期代替胸腺嘧啶(T)渗入正在复制的DNA分子中，通过基于EdU与Apollo®荧光染料的特异性反应快速检测细胞DNA复制活性，适用于细胞增殖、细胞分化、生长与发育、DNA修复、病毒复制、细胞标记示踪等方面。

实验流程

1. 每孔加入2 mg/mL甘氨酸，脱色摇床孵育5分钟后，弃甘氨酸溶液；

   ※ 注：作用是中和多聚甲醛，当采用其他方式进行细胞固定时可省略此步骤

2. 每孔加入100 μL PBS，脱色摇床清洗5分钟，弃PBS
3. 每孔加入100μL渗透剂(0.5% TritonX-100的PBS)脱色摇床孵育10分钟；PBS清洗1次，5分钟

   ※ 注：当实验需要进行其他抗体染色，或由于某些细胞类型对染料的吸附性较高，可能需要增强细胞膜通透性

4. 每孔加入100 μL的1X Apollo®染色反应液，避光、室温、脱色摇床孵育30分钟后，弃染色反应液
5. 加入100 μL渗透剂(0.5% TritonX-100的PBS)脱色摇床清洗2~3次，每次10分钟，弃渗透剂
6. （加强）每孔每次加入100 μL甲醇清洗1~2次，每次5分钟；PBS清洗1次，每次5分钟

   ※ 注：由于某些细胞对染料的吸附性较高，需采用加强方式洗脱以降低染料背景

7. 染DAPI，封片，镜检

实验步骤

1. 每孔加入2 mg/mL甘氨酸，脱色摇床孵育5分钟后，弃甘氨酸溶液；

   ※ 注：作用是中和多聚甲醛，当采用其他方式进行细胞固定时可省略此步骤

2. 每孔加入100 μL PBS，脱色摇床清洗5分钟，弃PBS
3. 每孔加入100μL渗透剂(0.5% TritonX-100的PBS)脱色摇床孵育10分钟；PBS清洗1次，5分钟

   ※ 注：当实验需要进行其他抗体染色，或由于某些细胞类型对染料的吸附性较高，可能需要增强细胞膜通透性

4. 每孔加入100 μL的1X Apollo®染色反应液（配置比例见表3），避光、室温、脱色摇床孵育30分钟后，弃染色反应液
5. 加入100 μL渗透剂(0.5% TritonX-100的PBS)脱色摇床清洗2~3次，每次10分钟，弃渗透剂
6. （加强）每孔每次加入100 μL甲醇清洗1~2次，每次5分钟；PBS清洗1次，每次5分钟

   ※ 注：由于某些细胞对染料的吸附性较高，需采用加强方式洗脱以降低染料背景

7. 染核：爬片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上避光晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后滴加dapi染液室温避光染核10min
8. 封片：爬片用PBS（PH7.4）洗涤3次，每次5min。爬片稍甩干后将有细胞的一面朝下用抗荧光淬灭封片剂将玻片封固在载玻片上封片
9. 镜检拍照：切片于尼康正置荧光显微镜下观察并采集图像。（紫外激发波长330-380nm，发射波长420nm；FITC绿光激发波长465-495nm，发射波长515-555 nm；CY3红光激发波长510-560，发射波长590nm）

案例：实验结果展示

结果判读

DAPI染出来的细胞核在紫外的激发下为蓝色，阳性表达为相应荧光素标记的红光或者绿光

送样运输要求

• 组织样本放置于20倍样本体积的固定液中固定24h以上，常温运输送样
• 石蜡切片常温保存运输
• 冰冻切片-20℃保存运输
• 细胞爬片固定液浸泡，4℃保存运输

注意事项

• 注意细胞核的分化程度
• 注意苏木素和伊红的效价，及时更换染液