技术介绍

晚期凋亡细胞中染色体DNA双链或单链断裂产生粘性3'-OH末端，在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)的催化下，将带有荧光素分子的dUTP标记到DNA的3'-末端，然后通过荧光显微镜观察、或进而用带有HRP的一抗染色后DAB显色，可以进行凋亡细胞的检测，该实验称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL)。

实验流程

1. 脱蜡至水--蛋白酶K修复--破膜通透--孵育tunel反应液--DAPI染核--抗荧光素淬灭剂封片-- 镜检拍照

实验步骤：

1. 1.样本预处理 ​冰冻切片/细胞样本 4%多聚甲醛室温固定30分钟→PBS洗涤3次→0.1% Triton X-100冰浴破膜2分钟→PBS洗涤。
   ​石蜡切片​ 脱蜡至水：二甲苯Ⅰ浸泡15分钟→二甲苯Ⅱ浸泡15分钟→无水乙醇梯度脱水（100%×2次→95%→85%→75%→蒸馏水）;​抗原修复：滴加20μg/ml蛋白酶K（PBS稀释），37℃孵育20-30分钟→PBS洗涤3次（每次5分钟）
2. 2.破膜与通透 0.1% Triton X-100室温处理20分钟（细胞样本可缩短至5-10分钟）→PBS洗涤3次
3. 3.TUNEL反应液配制与孵育 按试剂盒比例配制TUNEL反应液（TdT酶:荧光标记液:Buffer=2:29:50），现用现配；滴加50-100μL反应液覆盖组织，37℃避光孵育1-2小时→PBS洗涤3次
4. 4.​DAPI核复染 避光条件下滴加1μg/mL DAPI工作液，室温染色5-10分钟→PBS洗涤3次。
5. 5.​封片与镜检 抗荧光淬灭封片剂封片→4℃避光保存→24小时内完成荧光显微镜观察（FITC激发波长465-495nm，发射波长515-555nm）。

案例

TUNEL(荧光)检测-小鼠卵巢：

　TUNEL(荧光)检测-小鼠肠：

结果判读

• 凋亡细胞:细胞核呈现绿色荧光（FITC标记），与DAPI蓝色核染色重叠区域为双阳性
• 阴性对照：无TdT酶时，无绿色荧光信号（仅DAPI蓝色）；
• 阳性对照：DNase I处理后，所有细胞核均显示强绿色荧光。
• 定量分析：使用ImageJ软件统计绿色荧光面积占比或阳性细胞数/总细胞数×100%。

送样运输要求

• 石蜡切片常温；
• 冰冻切片-20℃；
• 固定后细胞爬片4℃。

注意事项

• ​必设对照：阴性对照（不加TdT酶）、阳性对照（DNase I处理）;
• 荧光稳定性：封片后24小时内完成拍摄，避免荧光淬灭；若需长期保存，选择抗淬灭封片剂；
• 试剂优化：高凋亡样本可延长TUNEL孵育至2小时，低凋亡样本需提高TdT酶浓度。