技术介绍

晚期凋亡细胞中染色体DNA双链或单链断裂产生粘性3'-OH末端，在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)的催化下，将带有生物素(Biotin)分子的dUTP，标记到DNA的3'-末端，随后和辣根过氧化物酶(HRP)标记的链酶亲和素Streptavidin (Streptavidin-HRP)结合，最后通过DAB显色来显示凋亡细胞，从而可以通过普通光学显微镜检测到凋亡的细胞，这就是TUNEL(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)法检测细胞凋亡的原理。

实验流程

1. 脱蜡至水--蛋白酶K修复--破膜通透--孵育tunel反应液--孵育POD反应液-- DAB显色--苏木素染核--脱水封片--镜检拍照

实验步骤

1. 1.石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ 20min-二甲苯Ⅱ 20min-无水乙醇Ⅰ 5min-无水乙醇Ⅱ 5min-85%酒精5min-75%酒精5min-蒸馏水洗。
2. 2.修复：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止液体流走），在圈内滴加蛋白酶K工作液覆盖组织，37度温箱孵育20min。将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
3. 3.（可选步骤）破膜：切片稍甩干后在圈内滴加破膜工作液覆盖组织，常温下孵育20min，将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
4. 4.阻断内源性过氧化物酶：将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片放入3%双氧水溶液，室温避光孵育20 min，将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
5. 5.室温平衡：切片稍甩干后在圈内滴加buffer覆盖组织，buffer常温孵育10min.
6. 6.加反应液：去掉平衡液，Recombinant TdT enzyme：Biotin-dUTP Labeling Mix：Equilibration Buffer=1 µL：5 µL：50 µL比例混合，加到圈内覆盖组织，切片平放于湿盒内，37℃温箱孵育1小时，湿盒内加少量水保持湿度。
7. 7.加Streptavidin-HRP反应液：将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。 Streptavidin-HRP和TBST按1：200比例混合，加到圈内覆盖组织，切片平放于湿盒内，37℃温箱孵育30min。将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
8. 8. DAB显色：切片稍甩干后在圈内滴加新鲜配制的DAB显色液，显微镜下控制显色时间，阳性为细胞核呈棕黄色，纯水冲洗切片终止显色。
9. 9.复染细胞核：苏木素复染1min左右，纯水洗涤，分化液分化数秒，纯水洗涤，返蓝，纯水冲洗。
10. 10.脱水封片：将切片经4缸100%酒精脱水，每缸5min, 随后在正丁醇中浸泡5min,放入二甲苯中进行透明，时间5min以上，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片。

案例

• TTUNEL(白光)检测-小鼠肿瘤
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• TUNEL(白光)检测-小鼠肾
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结果判读

苏木素染色核呈蓝色，DAB显色阳性凋亡细胞核呈棕黄色

送样运输要求

• 石蜡切片：常温
• 冰冻切片：-20℃
• 固定后细胞爬片：4℃

注意事项

• 蛋白酶K浓度与时间需优化，防止过度消化导致脱片；
• DAB显色需实时监控，避免背景过深；
• 内源性过氧化物酶需充分阻断（如肝脏样本）；
• 阴性对照（省略TdT酶）和阳性对照（DNase I处理）需同步设置。