技术介绍

晚期凋亡细胞中染色体DNA双链或单链断裂产生粘性3'-OH末端，在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)的催化下，将带有荧光素分子的dUTP标记到DNA的3'-末端，然后通过荧光显微镜观察、或进而用带有HRP的一抗染色后DAB显色，可以进行凋亡细胞的检测，该实验称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL)。

实验流程

1. 脱蜡至水--破膜通透--孵育tunel反应液--微波修复--加一抗4℃孵育过夜--加二抗--DAPI染核——抗荧光淬灭封片--镜检拍照

实验步骤

1. 1.石蜡切片脱蜡至水：1依次将切片放入二甲苯Ⅰ10min-二甲苯Ⅱ10min-二甲苯Ⅱ10min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-无水乙醇III5min -蒸馏水洗。(冬天应该适当延长脱蜡时间）
2. 2.蛋白酶K修复：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止液体流走），在圈内滴加蛋白酶K工作液覆盖组织，37度温箱孵育22min。将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。(蛋白酶K工作液配置方法，原液：PBS=1:9)
3. 3.破膜：切片稍甩干后在圈内滴加破膜工作液覆盖组织，常温下孵育20min，将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。(破膜液为0.1%triton. 配置方法，triron原液：PBS=1:1000)
4. 4.室温平衡：切片稍甩干后在圈内滴加buffer覆盖组织，buffer常温孵育10min.
5. 5.加反应液：5片子数量和组织大小取tunel试剂盒内适量TDT酶 ,dUTP，buffer按1:5:50比例混合，加到圈内覆盖组织，切片平放于湿盒内，37℃恒温箱孵育2小时，湿盒内加少量水保持湿度。
6. 6.DAPI复染细胞核：6切片用PBS（PH7.4）洗涤3次，每次5min。去除PBS后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。
7. 7.封片：7玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干，用抗荧光淬灭封片剂封片。
8. 8.镜检拍照：8切片于荧光显微镜下观察并采集图像。（DAPI紫外激发波长330-380nm，发射波长420nm，发蓝光；FITC激发波长465-495nm，发射波长515-555 nm，发绿光。

案例

• IF TUNEL双染检测：TUNEL绿+α-actinin红
• IF TUNEL双染检测：TUNEL绿+SMA红

结果判读

DAPI染出来的细胞核在紫外的激发下为蓝色，试剂盒为FITC荧光素标记，阳性凋亡细胞核为绿色

送样运输要求

• 石蜡切片：常温
• 冰冻切片：-20℃
• 固定后细胞爬片：4℃

注意事项

• 脱蜡时间需根据室温调整（冬季延长）；
• 蛋白酶K浓度与孵育时间需优化，防止过度消化；
• TUNEL反应液需避光配制，避免反复冻融；
• 封片后尽快镜检，防止荧光淬灭；
• 需设置阳/阴性对照（如DNase I处理组）。