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免疫荧光三标

技术介绍


免疫荧光三重标记即利用抗原抗体特异性结合原理,在同一张切片上3个抗原进行同时标记,从而实现定位,定性,半定量的分析


实验流程


1、石蜡切片脱蜡至水:依次将切片放入二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-85%酒精5min-75%酒精5min-蒸馏水洗。

2、抗原修复:组织切片置于盛满EDTA抗原修复缓冲液(PH8.0)的修复盒中于微波炉内进行抗原修复。中火8min停火8min转中低火7min,此过程中应防止缓冲液过度蒸发,切勿干片。自然冷却后将玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5min。(修复液和修复条件根据组织来确定)

3、画圈:切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈(防止抗体流走)

4、血清封闭:在圈内滴加BSA孵育30min。(一抗若是山羊来源,则加兔血清)

5、加***种一抗:轻轻甩掉封闭液,在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗,切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。(湿盒内加少量水防止抗体蒸发)

6、加对应的HRP标记的二抗:玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的HRP标记的二抗覆盖组织,室温孵育50min。

7、加CY3荧光增强剂:玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加CY3荧光增强剂,避光室温孵育10min. 孵育完后,玻片置于TBST中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5min

8、微波处理:组织切片置于盛满EDTA抗原修复缓冲液(PH8.0)的修复盒中于微波炉内加热处理,中火8min停火8min转中低火7min,去掉已经结合到组织上的一抗二抗,此过程中应防止缓冲液过度蒸发,切勿干片。

9、加第二种一抗:在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗,切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。(湿盒内加少量水防止抗体蒸发)

10、加对应的HRP标记的二抗:玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的HRP标记的二抗覆盖组织,避光室温孵育50min。

11、加FITC荧光增强剂:玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加FITC荧光增强剂,避光室温孵育10min. 孵育完后,玻片置于TBST中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5min

12、微波处理:组织切片置于盛满EDTA抗原修复缓冲液(PH8.0)的修复盒中于微波炉内加热处理,中火8min停火8min转中低火7min,去掉已经结合到组织上的一抗二抗,此过程中应防止缓冲液过度蒸发,切勿干片。

13、加第三种一抗:在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗,切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。(湿盒内加少量水防止抗体蒸发)

14、加CY5标记的荧光二抗:玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的CY5标记荧光二抗覆盖组织,避光室温孵育50min。孵育完后,玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5min。

15、DAPI复染细胞核:切片稍甩干后在圈内滴加DAPI染液,避光室温孵育10min。

16、自发荧光淬灭:切片稍甩干后,在圈内加入自发荧光淬灭剂5min,流水冲洗10min。

17、封片:玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5min。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。

18、镜检拍照:切片置于扫描仪下采集图像。(DAPI紫外激发波长330-380nm,发射波长420nm,发蓝光;FITC激发波长465-495nm,发射波长515-555 nm,发绿光;CY3激发波长510-560,发射波长590nm,发红光. CY5激发波长 608-648nm, 发射波长672-712,,CY5原本为正红色,为了与CY3区分开,我们设定为粉色光。 DAPI染出来的细胞核在紫外的激发下为蓝色,阳性表达为相应荧光素标记的红光,粉光,绿光 。


案例:实验结果展示



结果判读


DAPI染出来的细胞核在紫外的激发下为蓝色,阳性表达为相应荧光素标记的红光,粉光,绿光 。


送样运输要求


样本放置于20倍样本体积的固定液中固定24h以上,常温运输送样。

切勿固定时间过长,切勿冷冻结冰。

荧光三标只能做石蜡包埋切片,不能做冰冻切片和细胞爬片。


免疫荧光三标
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