津科生物采用MTT 细胞增殖检测试剂盒,对由诱导剂和抑制剂等引起的细胞增殖活性和细胞毒性的变化,进行体外检测。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性 MTT 还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒并沉积在细胞中,死细胞无此功能,在特定溶剂存在的情况下,可以被完全溶解,然后通过酶标仪可以测定570 nm波长附近的吸光度。在特定溶剂存在 的情况下,甲臜可以被完全溶解。MTT细胞增殖能力检测可以用于一些生物活性因子的活性检测、药物筛选、细胞毒性测定等。
1. 所有的管子在打开之前需要先离心。
2. 使用96孔板进行检测时,通常细胞增殖检测实验每孔加入100 μL 2000个细胞,细胞毒性检测实验每孔加入100 μL 5000个细胞(具体每孔所用的细胞的数目,需根据细胞的大小,细胞增殖速度的快慢等决定)。按照实验需要,进行培养并给予0-10 μL特定的药物刺激。在培养箱中孵育24小时。注意事项: 每个样品建议设置5个复孔。
3. MTT溶液的配制:用MTT Solvent(组分B)溶解 MTT Reagent (组分A),配制成5mg/mL的MTT溶液。配制后即可使 用,或直接-20°C避光保存,也可以根据需要适当分装后-20°C避光保存。
4. 每孔加入10μL MTT 溶液,使每个孔中的MTT的终浓度为0.5mg/ml。
5. 轻轻混匀后,5% CO2,37℃培养箱中孵育4小时。注意事项:孵育后,蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)沉积在细胞中。
6. 小心吸取每个孔中的培养基已防止细胞单层破裂。
7. 每孔加入100μL Formazan Solubilization Solution(组分C)
8. 将96孔板放在振荡器上轻轻震荡10分钟,直至在普通光学显微镜下观察发现甲臜全部溶解。
9. 在酶标免疫检测仪570nm测定吸光度。
确定空白对照的平均值,并从所有吸光度值中减去此值。根据测试化合物的浓度,在570nm处绘制校正后的吸光度值。利用Prism或其他数据分析工具,通过非线性回归分析确定细胞增殖的EC50值和细胞毒性化合物的IC50值。
1、实验信息,包括细胞类型,细胞处理药物和条件。
2、实验结果要求等。