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EMSA(凝胶迁移或电泳迁移率实验)

技术介绍


凝胶迁移或电泳迁移率实验(EMSA-electrophoretic mobility shift assay)是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术,适用于转录因子与启动子相互作用的验证性实验,主要是验证蛋白质与特定核酸序列的结合特性,从而间接推断已知蛋白质的靶序列或已知序列的结合蛋白质分子。可用于定性和定量分析。这一技术最初用于研究DNA结合蛋白,目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。

 

 

 


实验流程


探针设计合成-样本制备-预电泳-电泳-转膜-紫外交联-封闭-抗体孵育-洗脱-化学发光-结果分析


实验步骤


1)核蛋白提取(核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒,详细步骤见试剂盒说明书) 

2)制胶 (1.5mm胶,大约30min胶会凝)

待胶完全凝固后120v预电泳1h,缓冲液用预冷的0.5×TBE。

3)蛋白与探针反应(注:蛋白浓度1 μg/μl ,上样体积2 μl)

混合后室温放置25-30min。

4)上样

预电泳完后马上更换预冷的电泳缓冲液,加4μl的6×上样缓冲液到样品混合液中,马上上样电泳,150v ,60min。

5)电转移

将带正电的尼龙膜放入0.5×TBE中平衡10min。待电泳完成后将加有样品的整块胶取下电转。转膜缓冲液为预冷的0.5×TBE,300mA转印 30min。

6)交联

转膜完成后将膜取出,于紫外灯下20cm处作用20min。

7)封闭

将交联完成的尼龙膜取出放入洗净的孵育槽,用封闭液封闭20min。期间放于摇床上轻柔摇晃。(慢摇)。

8)抗体反应

倒掉封闭液。用封闭液将抗体稀释300倍后,与膜完全作用30min。期间放于摇床上轻柔摇晃。(慢摇).

9)洗脱

用1×的洗脱液清洗4次,每次10min。摇床速度加大。

10)ECL发光检测:

将膜从洗脱液中取出,稍微吸干上面的液体,放入化学发光仪中,加上化学发光液,待反应1-2min后,吸尽多余的液体,开始化学发光。

4、图像分析(灰度比分析结果见EXCEl表格)


案例:实验结果展示



 

 


送样运输要求


1.样本类型

(1)新鲜组织,100mg以上,干冰运输

(2)细胞量要求为10^7以上,收集细胞沉淀,干冰运输

(3)抗体要求为EMSA级别,-20或者4℃运输

2.客户提供

(1)基因信息、蛋白信息、物种信息

(2)转录因子特异性抗体







 


EMSA(凝胶迁移或电泳迁移率实验)
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