染色质免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation),简称CHIP;是目前研究体内DNA与蛋白质相互作用的***方法,它不仅可以检测体内反式作用因子与DNA的相互作用,还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达关系。
样本处理-超声检测-input检测及反馈-免疫沉淀-洗脱-产物检测-结果分析
实验步骤
一、input检测及免疫沉淀
1 day:
(一)细胞的甲醛交联与超声破碎
1、取出1平皿细胞,按照终浓度为1%的比例加入37%甲醛;
2、37℃孵育10min;
3、终止交联:按照终浓度为125mM的比例加2.5M甘氨酸于平皿中。混匀后,在室温下放置5min即可;
4、吸尽培养基,用冰冷的PBS清洗细胞3次;
5、用PBS将细胞刮下来,2000g离心5min,去上清;
6、加入含蛋白酶抑制剂的IP裂解液裂解细胞;
7、冰上充分裂解30min,过程中用枪反复吹打细胞,使其充分裂解;
8、超声破碎:超声过程中请一定注意要保持样品处于冰浴中,避免超声出现泡沫,并且处于较低温度;
(二)除杂及抗体哺育
1、超声破碎结束后,离心去除不溶物质,取上清;留取,其余保存于-80度。
2、取40μl留作Input的超声破碎产物,加入 5*还原型蛋白上样缓冲液10μl,加热变性后进行WB检测,确认样品中含有目标蛋白。剩下50μl产物加入5μl的蛋白酶K和2μl 5M NaCl(NaCl终浓度为0.2M),55℃过夜解交联;
3、解交联结束后,测核酸浓度,取部分样品进行PCR扩增,然后跑琼脂糖电泳,检测超声破碎的效果和确认样品中含有目标DNA;
4、Input结果确认后,取冻存在-80℃冰箱中的超声破碎产物100μl,加入 含1mM-PMSF的ChIP Dilution Buffer和20μl的50×PIC。再各加入Protein A +G Agarose/Salmon Sperm DNA。4℃颠转混匀1h;
5、1h后,在4℃静置10min沉淀,4000rpm离心5min;
6、将样品分装至两支1.5mL EP管,一管中加入目的蛋白IP 抗体1μg,另一管中加入对应种属的IgG 1μg。4℃颠转过夜;
2 day:
(一)免疫复合物的沉淀及清洗
1、孵育过夜后,每管中加入200μl Protein A+G Agarose/Salmon Sperm DNA,4℃颠转2h;
2、4℃静置10min后,4000rpm离心1min。除去上清;
3、依次用下列溶液清洗沉淀复合物。清洗的步骤:加入溶液,轻轻颠倒, 4000rpm离心3min,去除上清;
注:完成上述所有洗涤步骤后所获得的沉淀即可用于Western检测,在完成所有的洗涤步骤后,取30μl样品加入30μl SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(1X),沸水浴煮沸10分钟后上样进行WB;
4、现配elution buffer(0.5gSDS+0.42gNaHCO3+50ml水),加200μl至EP管;
5、加5M NaCl 8μL,Protease K 20μL,55℃过夜解交联;
3 day:
1、RT-PCR法
1.1、利用JASPAR等数据库预测转录因子结合位点,根据该结合位点设计引物并合成;
1.2、取0.2mL PCR管,配制反应体系
1.3、PCR扩增
1.4、扩增结束后,取产物跑胶,检测片段大小是否正确。
2、测序法
收集所得DNA,测浓度后送往测序公司。
培养U87、U251细胞,SP1抗体进行ChIP实验