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免疫共沉淀法Co-Immunoprecipitation

技术介绍


 免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。CO-IP是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。实验原理为:当细胞在非变性条件下被裂解时,完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留了下来。将靶蛋白的特异性抗体与复合物共孵育,形成“抗体-靶蛋白-目标蛋白”复合物,通过Proterin A/G纯化、SDS-PAGE银染、结合Western Blot及液相质谱等对两种蛋白之间是否存在相互作用进行定性分析。常被用于验证已知的两个蛋白质是否存在相互作用。

  


实验流程




实验步骤


1.细胞蛋白提取

1.1 细胞培养(贴壁细胞:100mm细胞培养皿中单层细胞长满80%-90%或者细胞培养瓶中细胞达到2-5×107个,悬浮细胞:离心收集细胞,细胞达到2-5×107个);

1.2 加适量预冷的IP细胞裂解液到细胞培养皿中(IP裂解液中加入蛋白酶抑制剂),4℃裂解细胞10min,期间用移液器反复吹打,然后将细胞悬浮液转移到1.5ml离心管中,继续冰上裂解20min;

1.3 12000rpm、4℃离心10min,将上清转入新的1.5ml离心管中,冰上操作,然后采用BCA法测定蛋白浓度;

1.4 取少量上清液变性后用于input实验,即WB检测靶蛋白。

2.组织蛋白提取

2.1 组织块用预冷的PBS洗涤2-3次,去除血污,剪成小块置于匀浆管中,加入10倍组织体积IP裂解液(使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂),机器匀浆。如果需要提高蛋白浓度,可以适量减少该IP裂解液体积;

2.2 将匀浆液转移至1.5ml离心管中,冰上裂解30min;

2.3 12000rpm,4℃,离心10min,收集上清,然后采用BCA法测定蛋白浓度;

2.4 取少量上清液变性后用于input实验,即WB检测靶蛋白。

3.免疫沉淀步骤

3.1 向阴性对照(IgG)组别蛋白上清液中加入1.0μg IgG(与IP实验用于沉淀的抗体种属来源相同的普通IgG)和20μL protein A/G珠子(使用前充分混匀),实验组别直接加入20μL protein A/G珠子,4℃摇转孵育1h;

3.2 2000g,4℃,离心5min,取上清;

3.4 加入1-10μL(0.2-2μg)抗体,然后4℃孵育过夜;

3.5 加入80μL protein A/G-珠子(使用前充分混匀),用手指轻轻弹匀,4℃孵育2h;

3.6 4℃,2000g,离心5min,小心吸去上清,注意不要吸到底部的珠子,收集免疫沉淀复合物;

3.7 将免疫沉淀复合物用1ml预冷的IP裂解液(不用加各种抑制剂)洗涤4次,每次4℃,2000g,离心5min,每次洗涤小心弃去上清;

3.8 ***一次洗涤之后,尽可能的吸去上清液,然后,加入80μL 1×还原型上样缓冲液,沸水煮10min, 4℃,1000g,离心5min取上清。

4、IB检测

4.1 取10μL上清样品用于WB检测。

4.2 结果分析详见EXCLE表格


案例:实验结果展示